T세포는 골수에서 발생한 전구세포로부터 유래하며, 흉선 내에서 복잡한 발달과정을 거쳐서 생성된다. 이러한 발달 과정은 수용체와 같은 세포표면 단백질과 세포신호전달 물질, 그리고 전사조절단백질을 포함하는 다양한 분자들에 의해서 조절된다. 표면에 αβ-TCR를 발현하는 T세포는 두 가지의 중요한 과정을 통해서 분화된다. 그 첫번째는 β-사슬의 유전자 재조합과정(b-selection)으로서 CD4나 CD8 공동수용체를 발현하지 않는 초기 발달 단계의 세포에서 일어난다. β-사슬의 유전자 재조합과정을 거친 후, 이 사슬의 발현에 따라 pre-TCR 복합체를 형성한다. Pre-TCR을 통해서 신호를 받은 DN 상태의 세포, 즉 그 표면에 CD4나 CD8을 발현하고 있지 않은 상태(double negative)의 미성숙 세포는 이 단계에서 6-8번 정도의 세포 증식과정을 거친 후, CD4와 CD8을 모두 발현하는 DP(double positive)상태의 세포로 분화한다. 두번째 과정은 TCRα사슬과 β사슬 모두를 발현하고 있는 DP 상태의 미성숙 T 세포에서 일어난다. TCRα 사슬의 유전자 재조합 후 발생한 αβTCR 중에서 주조식적합성항원(Major histocompatibility complex: MHC)과 펩티드 항원을 적절히 인식한 것만이 긍정적 선별(positive selection)에 의해 세포의 소멸로부터 구제되어 성숙한 T세포로 분화하게 된다.
abTCR 은 자가펩티드-MHC 복합체와 결합하여, DP상태의 미성숙 T세포에 적절한 신호를 전달하게 되며 이를 통하여 CD4 혹은 CD8 만을 표면에 발현하는 성숙한 SP(single positive) T 세포로 분화한다.
TCRㅡ자가펩티드ㅡMHC 복합체간의 결합을 통한 적절한 신호가 세포 내로 전달될 때만이 DP 상태의 T세포는 긍정적 선별과정을 통하여 세포소멸 과정으로부터 구제되어 CD4 혹은 CD8 만을 표면에 발현하는 성숙한 SP(single positive) 상태의 T세포로 분화한다. TCR이 자가펩티드ㅡMHC 복합체와 너무 강하게 결합할 경우 부정적 선별과정(negative selection)을 통하여 세포사멸이 일어난다. TCR이 자가펩티드ㅡMHC 복합체와 약하게 결합하면 RasGRP를 통하여 Ras 신호 전달경로를 활성화 시키게 되고, 약하고 지속적인 ERK 신호를 발생시켜 긍정적 선별이 일어나게 된다. 하지만 TCR이 자가펩티드ㅡMHC 복합체를 너무 강하게 인식할 경우 강하고 짧은 지속시간을 가지는 Grb2/SOS1을 경유한 ERK 신호가 활성화 되고, JNK와 p38 신호전달을 통하여 부정적 선별과정을 거치게 된다.
T세포의 선별과 성숙과정은 유전자의 전사 단계에서도 조절된다. 특정한 전사조절인자의 발현과 외부의 신호에 의한 크로마틴 형태의 변화도 이러한 조절 과정에 중요하다. T세포의 선별과정에 관여하는 전사조절 인자들은 많이 밝혀져 있다. E2A가 없는 생쥐의 경우 긍정적 선별과정이 향상되어 있는 현상을 보여준다. 하지만 E단백질의 기능을 억제하는 Id3 단백질이 없는 생쥐의 경우 이러한 긍정적 선별과정이 감소하여 있음을 확인할 수 있다. Shn-2와 SAP-1 역시 이 과정에 필요한 인자이며, Nur77과 E2F1, 그리고 IkB의 경우 세포사멸과 부정적 선별과정에 관여한다고 알려져 있다. 또한 Notch와 Runx, GATA-3 그리고 cKrox 의 경우 T세포의 분화와 계열선택(lineage decision)에 관여 한다고 알려져 있다. 이와 같이 T세포의 발달에 관여하는 많은 유전자들이 알려져 있지만, 이러한 다양한 유전자들의 발현이 어떻게 조절되는지에 대한 정확한 기작은 여전히 불명확한 상태이다.
최근의 연구 결과들에 의하면 크로마틴 리모델링이 T세포의 성숙과정에 관여한다는 사실들이 밝혀지고 있다. ATP 가수분해 에너지를 이용하는 크로마틴 리모델링 복합체에는 크게 세가지 그룹이 존재하는데 SWI/SNF, ISWI 그리고 Mi-2 가 그것이다. ISWI 복합체는 TCR 유전자의 발현에 그리고 Mi-2의 경우엔 CD4 유전자의 발현에 관여한다. 그리고 SWI/SNF 복합체의 경우엔 T세포의 분화과정에 있어서 특히 계열 결정과정에서 특정 유전자 발현을 조절하는 중요한 기능을 가진다. SWI/SNF 복합체의 한 구성인자인 BAF57 유전자에서 high mobility group 부분이 망가질 경우 CD4 유전자의 억제에 문제가 생기게 되는데, 이 결과를 통해서 SWI/SNF 복합체가 CD4 유전자의 발현에 어떠한 역할을 한다는 것을 짐작할 수 있다. 또한 SWI/SNF 복합체의 구성인자 중에서 ATPase 활성을 가지는 BRG1 유전자를 흉선 특이적으로 제거시킬 경우 DN단계의 미성숙 T 세포에서 CD4 유전자의 억제현상이 사라지게 되고, DN 상태에서 DP 상태로의 발달 단계에 문제가 발생한다. 하지만 앞선 두 가지 실험의 경우 모두 DP 상태의 미성숙 T 세포가 생성되는데 어려움이 있기 때문에, DP 상태에서 SP 상태로 발달하는 과정에서의 크로마틴 리모델링 복합체의 기능을 알 수는 없었다. 긍정적 그리고 부정적 선별과정에 관여하는 많은 전사조절인자들이 알려져 있음에도 불구하고 아직까지 이러한 과정에 크로마틴 리모델링 활성이 어떠한 기능을 하는지에 대해서는 알려져 있지 않다.
SRG3 (SWI3-related gene)는 인간의 BAF155 유전자와 유사성을 가지는 생쥐 유전자로서 SWI/SNF 복합체의 중요 구성인자중의 하나이다. ATPase 활성을 가지는 BRG1도 중요한 인자이지만 EKLF에 의한 전사조절 과정에서 BAF155가 없이 BRG1 단독으로는 기능할 수 없다고 알려져 있다. 이러한 결과들을 통해서 SRG3가 SWI/SNF 복합체의 중요한 구성인자임을 알 수 있다. 하지만 이러한 SWI/SNF 복합체를 구성하는 여러 인자들간의 단백질 간의 결합에 관해서는 많은 연구가 되어있지 않다. SRG3 유전자에는 여러 중요한 영역(domain)들이 존재하는데 SANT (SWI3, ADA2, N-CoR, and TFIIIB B) 도메인과 SWIRM (SWI3, RSC8 and MOIRA) 도메인, LXXLL 모티프와 leucine-zipper 모티프, 그리고 proline과 glutamine이 많이 존재하는 (proline- and glutamine-rich)영역들이 그것이다.
SWIRM 도메인은 SWI3와 RSC8 그리고 MOIRA에 공통적으로 보존되어있는 85개의 아미노산으로 구성되어 있는 α 나선 구조로 추정되는 부분으로서, 특정한 단백질들 간의 결합에 관여할 것으로 생각된다.
이러한 SRG3 단백질의 구조와 최근 BAF155와 BAF170이 BAF57을 단백질 수준에서의 안정성 조절에 관여한다는 사실을 통해서, SRG3/BAF155가 SWI/SNF 복합체를 구성하는 다른 인자들과 직접적으로 결합하고, 전체적인 복합체의 화학량론적인 단백질 수준의 조절 유지에 중요한 역할을 할 것이라 추정할 수 있다.
최근의 본 연구그룹의 결과를 통하여 긍정적 선별과정 후에 SRG3의 발현이 감소하고, 이것이 미성숙 T세포가 GC(Glucocorticoid)에 저항성을 가지게 되어 세포사멸로부터 살아남는 과정에 중요하다는 사실을 밝혔다. 또한 SRG3의 발현이 TCR과 Notch1의 신호전달 과정에 의해서 억제하고, E2A/HEB 단백질에 의해서 발현이 증가됨을 보였다. TCR에 의한 SRG3의 발현 감소 현상은 Id3 단백질의 발현에 의해서 E2A/HEB 복합체의 기능이 저하됨으로써 일어나고, Notch1에 의한 SRG3 유전자의 발현 감소는 보조 활성 단백질인 p300이 SRG3 유전자의 프로모터 부분에 붙는 과정이 저해됨으로써 일어난 결과이다. 이러한 결과들은 DP상태의 T세포에서 SRG3 유전자가 매우 정교하게 조절되고 있다는 것을 의미하며, SRG3의 발현 조절을 통해서 SWI/SNF 복합체의 크로마틴 리모델링 활성이 조절되고 이를 통하여 DP 상태의 T세포에서의 분화 및 성숙과정이 조절됨을 제시하여 준다.
이 논문에서는 SRG3가 SWI/SNF 복합체의 다른 구성인자들과 직접적으로 결합하고 이를 통하여 단백질 수준에서 복합체 전체의 안정성을 높인다는 사실을 보여준다. 또한 SRG3의 발현 조절을 통해서 크로마틴 리모델링의 활성이 조절됨을 밝혔다. 그리고 발달중인 T 세포에 인위적으로 SRG3를 계속적으로 발현시킴으로써 DP상태에서 SP 상태로 분화되는 과정에서 SRG3의 발현이 감소되는 과정을 억제시켰을 때, 긍정적 그리고 부정적 선별과정에 문제가 발생함을 알아내었다. 이러한 결과들은 처음으로 T 세포의 선별과 발달 그리고 분화과정에서 크로마틴 리모델링 활성이 정교하게 조절된다는 사실을 시사해준다.
Chromatin Remodeling Complex
|
진핵생물의 유전자는 크로마틴 (Chromatin) 이라는 구조로 형성되어있다. 크로마틴은 실재 유전정보가 들어있는 DNA와 히스톤 (Histone) 단백질로 구성되어 있는 아주 복잡한 구조이다. 이러한 이유로 어떠한 특정한 유전자의 발현을 위해서는 염색체의 물리적인 구조적인 변화가 필요하게된다. chromatin 의 구조적 물리적 변화에는 크게 두가지 현상을 살펴볼 수 있다.
그 첫번째로, HDAC, HAT, 그리고 E3 ubiquitin ligase 와 같은 histone modifying complex 에 의해서 DNA를 싸고 있는 histone 단백질의 K(lysine) residue 에 methylation, acetylation, ubiquitination, sumoylation 등의 변화이다. (histone code 의 변화).
두번째로는 ATP 의 가수분해 에너지를 이용하여 실제적으로 물리적인 염색체의 구조적인 변화를 가져와서 여러 전사인자 (transcription factor) 들의 결합을 매개시켜 주고 유전자의 발현에 영향을 주는 Chromatin remodeling complex 가 있다.
Chromatin remodeling complex의 종류에는 크게 ATPase activity 를 가지는 subunit 의 종류에 따라서 크게 SWI/SNF complex 와 ISWI, 그리고 Mi-2 complex 3개의 family 로 나눌 수 있다. 세개의 complex 중에서 가장 연구가 많이 된 것은 SWI/SNF complex 로서 11개의 subunit 으로 이루어져 있다. 는 우리 실험실에서 주로 연구를 하고 있는 SRG3 는 Swi3-related gene 으로서 SWI/SNF complex 를 이루는 11개의 subunit 중 Brg1, BAF47 과 함께 core subunit 의 한 종류인 human 의 BAF155 와 유사성을 가진 유전자이다.
SRG3 의 domain
SRG3는 다른 SWI/SNF complex를 구성하는 구성원들의 안정성을 높여준다.
SWI/SNF complex의 각 component들은 stoichiometrically 정교하게 그 량이 post-transcription level에서 조절되고 있다. 즉, 전체적인 complex가 protein수준에서 매우 안정하게 존재하고 있는데, 아직까지 그 안정성의 분자적 매커니즘에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 본 실험실의 연구에 따르면 core subunit인 SRG3가 scaffold 단백질로서 기능하면서 전체적 complex의 stability를 조절하고 있음을 알 수 있다. SRG3를 과발현 시켰을 때, BAF60a, BAF47(Snf5), Brg1 등의 core subunit을 포함하여 SWI/SNF complex를 구성하는 다른 subunit 들을 단백질 수준에서 stability를 높임을 확인할 수 있었다. 또한 반대로 siSRG3 construct를 이용하여, SRG3를 knock-down시켜 SRG3의 발현을 낮추었을때, 각 subunit들 역시 protein 수준에서 그 량이 감소해 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 in-vitro상의 결과를 바탕으로 CD2 promoter를 이용하여 흉선 특이적으로 SRG3를 과발현 시킨 쥐를 분석하여 보았때을 때, SWI/SNF complex의 subunit들의 발현이 NLC에 비하여 정량적으로 증가해 있음은 물론, 전체적인 complex의 chromatin remodeling activity 역시 높아져 있음을 확인할 수 있었다.
SRG3의 조절 매커니즘
최근까지 이어지는 여러가지 실험결과에 따르면 T-세포의 발생 및 분화에 SWI/SNF complex가 관여하고 있음이 밝혀졌다. 하지만, 어떻게 이것들이 조절되는지에 대한 연구는 미흡한 실정이다. SRG3가 전체 complex의 scaffold protein으로 역할을 하기 때문에, SRG3의 조절 기작을 연구하는 것은 결국 전체 complex의 적절한 조절 기작을 이해하는 중요한 실마리를 제공할것이라 생각하여, 본 실험실에서는 SRG3의 expression regulation에 대한 연구를 하여, 많은 결과들를 얻을 수 있었다.
우선 CD2S-RG3 transgenic mice 분석을 통해 SRG3가 글루코코르티코이드 (GC) 수용체와 복합체를 형성하여 GC에 의한 Apoptosis (세포사멸)를 활성화시킨다는 것을 밝힐 수 있었다. 또한 T cell Receptor(TCR) signal에 의한 Id3 의 발현, Notch1 의 활성화, 그리고 nitric oxide(NO)에 의해서 SRG3의 발현이 감소됨을 밝혔낼 수 있었다.
이렇듯 SRG3는 T cell 발생과정 중에 정교하게 조절된다. TCR signal을 통해서 positive selection과 negative selecion을 거쳐, CD4 SP와 CD8 SP로 분화될 때, SRG3의 level이 줄어들면서 전체적인 complex도 줄어들게된다. 본 실험실에서는 CD2-SRG3 transgenic mice를 제작하여 T cell 이 DP->SP로 분화되는 동안 SRG3 의 량이 줄어드는 것을 극복하여 보았다. 이 결과 positive selection과 negative selection과정에 문제가 있었다. 전체적으로 selection window가 변화하였다. 이러한 결과로 볼때, T cell 의 발달과 분화에 SWI/SNF complex의 정교한 조절이 필요하고, 이러한 과정은 SRG3를 통하여 일어남을 확인할 수 있다. 또한 SRG3 유전자 결손생쥐는 배아발생이 발생 초기단계에서 정지하며 일부 SRG3 /- 생쥐에서는 신경세포의 비정상적 분열 및 분화로 인해 정상적인 뇌 발생이 일어나지 않는다. 배아 발생 초기 동안 Brg1의 발현은 발생과정 전반에 걸쳐 뇌와 척수 등 특정 조직에 국한된 반면, SRG3의 발현은 보다 광범위한 조직에서 관찰된다.
면역세포의 분화 및 기능 조절
각종 생쥐모델을 이용하여 골수에서 B/T세포의 운명 결정 및 B세포 분화, 흉선에서 T세포 분화 및 선별과정, 조절 T세포 (regulatory T cell) 발생 그리고 자가면역 조절에 있어 SRG3의 기능을 분석하고 있다. 특히, 이 과정에서 Wnt/b-catenin 경로, Egr-1, E2F-1 및 p53과 SRG3간 기능적 상관성을 분석 중에 있다. 또한 SRG3에 의한 IL-10 발현 조절과 조절 T세포의 발생 및 기능 조절에 대한 분석, 그리고 자가면역과의 연관성에 관한 연구가 진행 중이다.
초기 배아의 발생 및 배아간세포의 분화 조절 인자 규명
SRG3 결손생쥐에서 SRG3 발현을 회복시킴으로써 SRG3 결손에 의한 초기 배아 사멸을 극복하고 그 원인을 분석하고자 한다. 또한 SRG3 결손이 초기 배아의 혈관형성에 미치는 영향도 분석 중이다. 또한 in vitro에서 인간의 배아간세포의 분화를 유도시킨 후 각 분화단계에서 유전자 발현 양상을 분석하였으며, ES cell의 분화억제에 관여하는 여러 유전자의 프로모터에 결합할 것으로 예상되는 여러 전사조절인자를 분석하여 신규 전사조절인자를 선별하고 이들의 기능을 분석 중이다.
SRG3와 상호작용하는 여러 단백질에 대한 분석
Yeast two-hybrid기법을 통해 우리는 SRG3와 복합체를 형성하는 여러 단백질을 동정하였다. 이를 통해 Snf5 및 Twist-2 등이 분리되었으며, 이와 더불어 E2F-1, Baf60a, p53 단백질들과의 상호작용에 대한 구체적 기작 및 생물학적 의의에 대한 분석이 진행 중이다. 특히, Twist-2의 경우, T-세포 분화에 미치는 영향을 분석하기 위해 T세포 특이적으로 Twist-2를 과발현하는 생쥐를 제작하여 그 기능을 분석 중이다.