이 방법은 T-DNA insertions 주위의 genomic DNA sequences의 mapping과 발견에 유용하게 쓰인다. 

이미 우리가 알고 있는 inserted DNA sequence를 이용하여 그 주위의 DNA sequence를 알아내어 원본 genomic DNA sequence와 비교하여 어느 유전자 서열에 우리가 넣은 유전자가  들어갔는지 알수 있다.

TAIL-PCR은 2~3번의 PCR로 gene의 위치파악이 가능하고 신속하고, 대용량도 가능하고, 정확도도 높다.

# TAIL-PCR 준비물
PCR을 하기 위해서는 2개의 primer가 필요하다.
TAIL-PCR에서는 연속된 3개의 specific primer와 어느 random한 sequence에 붙는 AD primer가 필요하다. 한 종류의 genomic DNA sequence 붙을 수 있는 서열을 많이 늘려서 AD 프라이머가 붙을 수 있는 확률을 늘린다(degeneracy). 처음에 제작한 AD primer가 template 에 붙지 않을 경우, fold가 늘어난 다른 AD 프라이머를 제작하고 그 양을 늘려서 붙을 수 있는 확률을 늘린다. 

1. AD primer의 제조
14~16 mer로 구성된 sequence로서 64~256 fold를 가진 Tm 45°C를 가지는 primer 이다.
AD primer의 요건은 Genomic DNA에 random하게 어느 특정 sequence에 붙어야 하므로, 붙는 확률을 높여줄 필요가 있다. 그래서 degeneracy를 이용한다.

* degeneracy
여러 개의 codon이 1개의 amino acid를 coding하는 의미이다.
TAIL-PCR은 AD primer가 여러조합의 sequence에 붙을 확률을 얼마나 높여주느냐에 따라 실험의 성패가 좌우된다.

2. specific primer의 제작
Inserted DNA sequence와 동일한 연속된 세부분의 sequence로 구성된 23 ~ 25 mer로 구성된 Tm 60°C인 primer이다. → 이 specific primer는 inserted T-DNA의 DNA sequence와만 base pairing을 하게 된다. 일단 밑에있는 설명에서는 차례대로 primer를 제작하되 가장 바깥쪽에서 짠 primer를 순서대로 T1,T2,T3로 명명한다.

>>> 따라서  PCR 결과를 gel electrophoresis에서 보면 위 세 가지 PCR products가 약간의 길이의 차이로 점점 아래로 band가 형성되게 된다.

-----TAIL-PCR 실험과정-----

1. 첫 번째 PCR 과정(with T1 and AD primer)

(1) 94°C로 gDNA를 denature 시킨다.
(2) 두개의 denatured ssDNA에 specific primer인 T1 primer를 넣어서 62°C로 온도를 내리면 gDNA와 T1 primer 둘만 결합하게 된다. 여기에서 PCR extension을 한다.
(3) Inserted DNA에 붙은 T1 primer에서 새로운 아주 긴 ssDNA가 생성된다.
(4) 이 결과물에서 94°C로 다시 denature시키면 세개의 ssDNA로 분리가 된다. 여기에 AD primer를 넣어서 25°C로 온도를 낮추면 gDNA sequence에 어떤 부위에 AD primer가 random하게 붙게 된다.
(5) PCR extension을 통해서 새로운 3개의 ssDNA가 생긴다. 그 중 가운데에 생성되는 T1과 AD primer에 의해 생성되는 그 ssDNA sequence가 우리가 원하는 것이 되지만, 4종류 이상의 다른 PCR product가 나오는데 T1과 T1 primer에 의해 생성된 PCR product, AD와 AD primer에 의해 생성된 PCR product, T1과 AD primer에 의해 생성된 PCR product, Inserted DNA에 T1 primer와 AD primer가 붙어 생성된 우리가 원하는 PCR product (보통량이지만, 잘 detect 되지 않음)가 그것이다.

2. 두번째 PCR 과정(with T2 and same AD primer)

 첫 번째 PCR에서 나온 PCR product에는 우리가 원하는 DNA sequence외에 다른 DNA sequence가 많이 있으므로 1000배 dilution을 하여 다시 T2 primer와 AD primer를 넣어 PCR을 한다.
그러면 실제로 T2 primer는 inserted DNA sequence를 가진 PCR product DNA sequence에만 붙게 된다. 그러므로 PCR product의 gel electrophoresis 결과는 크게 두가지로 나오는데, 하나는 Inserted DNA에 T1 primer가 결합하여 만든 PCR product, AD primer와 AD primer에 의해 나온 것이 생성되게 된다.
∴  T2 primer는 inserted DNA sequence를 토대로 primer를 짤때 T1 primer와 상보적인 부분보다 더 안쪽으로 만들었으므로 gel electrophoresis 의 band 의 위치는 첫번째 PCR band 보다 약간 짧아지게 되어 더 아래쪽에 형성된다.

3. 세번째 PCR 과정(with T3 primer and the same AD primer)

두번째 PCR의 product를 다시 T3 primer를 넣어 PCR하면, 우리가 원하는 inserted DNA sequence에 T3 primer가 결합한 T3 와 AD primer에 의한 PCR product가 나오게 된다. 우리가 원하는 DNA sequence band는 gel electrophoresis에서 band의 위치가  두번째 PCR의  band 보다 약간 더 짧아지게 되어 더 아래쪽에 형성된다. 계속 짧아진 band에서 우리가 원하는 DNA sequence를 얻게 되었으면, 이 band를 DNA sequencing을 한 다음 이 sequence 정보를 원본 gDNA와 비교하여 어떤 곳에 T-DNA가 위치하고 있는지를 알 수 있다.