어제 bin2-lof 201  T2 RNA extraction하려고 보니, powder 가 한번 녹았다가 다시 언것 같더라구요.. 상태가 좋아보이지 않아, 우선 T3각 라인 받은걸 몇개씩 뿌려서 일주일정도 키운 후 RNA 뽑기로했습니다.

문제가 있는데요, 201 vector는 앞에 35S와 taq(HA)이 있고 뒤엔 아무것도 없거든요. 이 경우엔 뒤에 stop codon을 넣었어야 했는데, LR을 할 때 101(뒤에 YFP, HA),201(HA),301(FLAG)을 동시에 했었거든요. 뒤에 스탑코돈 없는 엔트리로 같이 LR을 해서, 뒷 부분에 stop codon이 없을 껍니다.

예전 BIN2로 클로닝 했을 때도 마찬가지구요.

BIN2-flag 을 전사레벨 확인했을때, 전사량이 올라가있었고 flag으로 단백질이 잡히긴 했지만 BIN2 뒷부분까지 번역이 되어있는지는 모르는거지요..

BIL1,2 는 우선 101 (뒤에 YFP,HA)로 LR하구요..

BIN2는 우선은 101에 들어간  라인들로만 진행해야될것 같습니다.

FLS2 는 계속 PCR이 안되던걸 다시 해보고 있습니다.